包装规格：

产品简介：

??超敏ECL发光底物是一种用于检测免疫印迹膜上HRP(辣根过氧化物酶)标记的目的条带的高灵敏增强底物。这一独特的发光底物系统是目前最灵敏的商业化荧光ECL检测试剂，具有极高灵敏度和高信噪比。

??产品特色：

??发光迅速：通常1-5秒既出结果;

??极高灵敏度和高信噪比;

??使用方便：可在日光灯下进行发光实验，(短时间暴露实验室常规照明不会损伤该试剂)。

使用方法：

??1. 将印记膜从蛋白转印设备中取出,加入合适的封闭液在温室下孵育20-60分钟,同时振荡;

??2. 将膜从封闭液中取出,与一抗工作液在温室孵育1小时,同时振荡或在28℃孵育过夜,不振荡;

??3. 用适当的缓冲液充分洗涤印迹膜。(将足量的洗涤缓冲液加至膜上,保证缓冲液将膜完全覆盖,振荡孵育>5分钟,更换洗涤缓冲液并重复该步骤4-6次。增加洗涤缓冲液体积,洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号);

??4. 用10-50 ng/mL二抗孵育印迹膜约30-60分钟;

??5. 重复步骤3,以除去未结合的HRP标记二抗(膜与HRP标记二抗孵育后必须进行彻底洗涤);

??6. 通过混合等份的本产品溶液A和本产品溶液B来制备发光工作溶液。每平方厘米印记膜使用0.1 mL发光工作溶液。已配制的工作溶液在室温下可稳定保存8小时。(注:暴漏于日光或任何其他强光下可能损害工作液,为获得最佳结果,将此工作液保存在琥珀色瓶中,并避免长期暴漏于任何强光,实验室的常见照明不会损害工作液的稳定性);

??7. 将印迹膜置于新配置的工作溶液中孵育5分钟;

??8. 去除多余的工作溶液;

??9. 将印迹膜放在透明的塑料包装或薄片保护膜中,去除气泡 10将印迹暴露于X射线胶片或成像系统。

??抗体稀释参考

??为获得最佳显色效果,必须优化该系统的全部组分,包括样品量、一抗和二抗浓度以及膜和封闭试剂的类型。??注意事项

??1.使用该产品比使用沉淀比色HRP底物检测所需的抗体浓度低。为优化抗体浓度,请进行一次系统的点印迹分析;

??2. 工作液在室温下8小时内可以保持稳定,但是应该避免暴露在阳光下或任何其他强光环境,然而短期实验室照明强度不会破坏工作液的稳定性;

??3. 封闭试剂有可能与抗体产生交叉反应,导致出现非特异性信号。封闭缓冲液同时也会影响系统的灵敏性,当从一种底物转换为另一种底物时,有时会出现信号衰减或背景增加的现象,原因可能是封闭缓冲液不适合新的检测系统;

??4. 使用亲和素/生物素检测系统时,避免使用牛奶作为封闭试剂,因为牛奶中含有不定量的内源性生物素,会导致高背景信号;

??5. 保证洗涤缓冲液、封闭缓冲液、抗体溶液和底物工作液的使用体积,以确保在整个实验过程中印迹膜完全被液体覆盖,避免膜变干。增大封闭缓冲液及洗涤缓冲液的使用量可以降低非特异性的信号;

??6. 为获得最佳效果,在孵育步骤请使用摇床;

??7. 将Tween20(终浓度0.05-0.1%)加入封闭缓冲液和稀释的抗体溶液,以降低非特异信号;

??8. 不要使用叠氮钠作为缓冲液的防腐剂,叠氨钠是HRP的抑制物;

??9. 避免手与膜直接接触,实验过程应戴手套或使用干净的镊子;

??10. 所有设备必须清洁且不沾染外来物质,金属器械(如剪刀)不得具有可见的锈迹,锈？赡艿贾掳叩阈纬珊透弑尘。

??图像获取

??1. 将包在塑料纸(膜)中的印迹膜置于胶片暗盒中，蛋白质面朝上，除适用于胶片曝光的灯(如红色安全灯)之外，关闭所有灯;

??注: 胶片必须在曝光期间保持干燥,为获得最佳效果,采取以下措施:

??确保将多余的底物溶液从膜和塑料纸上完全去除;

??在整个胶片处理期间,使用手套;

??切莫将印记膜置于已显影的胶片上,因为胶片上的化学物质会减弱信号。

??2. 将X光胶片置于膜的上面。建议第一次曝光60秒。之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前5-30分钟期间是最强烈的,这一反应可以持续几个小时,但强度会随时间下降,如有底物孵育后较长时间后曝光,曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使用磷光存储成像设备(如Bio-Rad的分子成像仪系统)或CCD照相机可能需要较长的曝光时间;

??3. 使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号太强,则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。

??其他材料准备

??已完成转印的印迹膜:使用任何合适的电泳法分离蛋白质,并将这些蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,也可使用其他类型的膜,但操作步骤可能需要进行优化;

??用于处理放射显影胶片的胶片暗盒、显影和定影试剂

??用于孵育的旋转摇床;

??稀释缓冲液:使用Tris或磷酸盐缓冲液;

??洗涤缓冲液:将5mL 10%的Tween-20加入1000 mL稀释缓冲液(Tween-20的终浓度将为0.05%);

??封闭试剂:将0.5mL10%的Tween-20加入100 mL的封闭缓冲液,选择一种与稀释缓冲液具有相同基本组分的封闭缓冲液;

??一抗:选择一种目标蛋白质特异性抗体,使用稀释缓冲液制备该抗体的1 mg/ml储液。使用封闭试剂将抗体从储液稀释成抗体工作液。稀释度介于1:1,000和1:5,000之间或抗体工作液浓度为0.2-1 ug/mL。最佳稀释度取决于一抗和膜上的抗原量;

??HRP标记的二抗:选择一种与二抗特异性结合的HRP标记二抗,使用稀释缓冲液制备该抗体的1 mg/ml储备液。使用封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体工作液。稀释度介于 1:20,000和1:100,000之间或抗体工作液浓度为10-50ug/ml,该浓度范围在使用链亲和素 HRP时也适用。二抗的最佳稀释度取决于HRP标记二抗和膜上的抗原量

??常见问题